中山三院邱偉團(tuán)隊等發(fā)表國際創(chuàng)新抗體檢測，快速診斷神經(jīng)免疫病

9月5日，國際神經(jīng)病學(xué)頂級期刊JAMA Neurology （影響因子29）在線發(fā)表了國際創(chuàng)新技術(shù)-免疫斑點法（IDoT）檢測水通道蛋白（AQP4）抗體的研究論著。這是目前國內(nèi)神經(jīng)免疫抗體檢測首個發(fā)表于該期刊的研究，在國際神經(jīng)免疫病研究領(lǐng)域發(fā)出了中國聲音，也體現(xiàn)了國際同行對中國開展國際臨床合作研究的認(rèn)可。邱偉（中山三院，末位通訊）、Ho Jin Kim（韓國NCC）為共同通訊作者；付瑩（福建附一）、畢錦（福建附一）、閆亞平（陜西師大）、孫曉渤（中山三院）為共同第一作者。該研究得到了天津醫(yī)大總醫(yī)院施福東、廣醫(yī)二院龍友明、福建附一李銳等專家的指導(dǎo)。

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圖1：原文鏈接：https://jamanetwork.com/journals/jamaneurology/fullarticle/2809143?resultClick=1

doi:10.1001/jamaneurol.2023.2974

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視神經(jīng)脊髓炎視譜疾病（NMOSD）是神經(jīng)免疫病的一種，亞洲女性好發(fā)。NMOSD會反復(fù)發(fā)作視神經(jīng)炎和脊髓炎，最終造成神經(jīng)功能障礙，給家庭、社會造成負(fù)擔(dān)。目前，NMOSD診斷依賴外周血水通道蛋白4（AQP4-IgG）抗體檢測，因此，基于細(xì)胞表達(dá)的抗體檢測方法（CBA）于2015年被國際NMOSD診斷指南推薦，作為當(dāng)今AQP4-IgG抗體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，CBA法耗時3-7天，且需要特殊實驗室和技術(shù)人員等，大大限制了CBA法的廣泛使用，尤其在一些NMOSD高發(fā)、但醫(yī)療條件欠發(fā)達(dá)的地域；并且，目前商品化的檢測試劑盒仍依賴國外進(jìn)口，檢測成本極高。

圖2：傳統(tǒng)CBA檢測方法。目前傳統(tǒng)CBA檢測方法包括活細(xì)胞CBA與固定 CBA，前者需要轉(zhuǎn)染質(zhì)粒使293T細(xì)胞過表達(dá)AQP4抗原，患者血清樣本作為一抗通過抗原抗體結(jié)合原理，再通過流式細(xì)胞術(shù)或者免疫熒光顯微鏡現(xiàn)場觀察患者AQP4-IgG抗體；后者是將轉(zhuǎn)染成功的293T細(xì)胞進(jìn)行固定處理后染色觀察。由于技術(shù)要求高，國際上僅少數(shù)中心提供活細(xì)胞CBA檢測，而固定CBA相對容易獲得，但仍對實驗儀器如熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀等要求較高。

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解決傳統(tǒng)AQP4-IgG抗體檢測的瓶頸，是全球神經(jīng)免疫學(xué)者關(guān)注的重點，同時中國人作為NMOSD高發(fā)人群，我國亦迫切需要具有自主知識產(chǎn)權(quán)的可靠檢測方法。面對臨床需求，中山三院、福建附一、陜西師大與國際學(xué)者組成聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊，從臨床問題出發(fā)，依托中國南方NMOSD臨床隊列，開展基礎(chǔ)-臨床結(jié)合的轉(zhuǎn)化研究，共同進(jìn)行抗體檢測新技術(shù)的研發(fā)與驗證。研究過程中，閆亞平團(tuán)隊首先利用表達(dá)AQP4的細(xì)胞提取的膜碎片（帶有完整AQP4空間構(gòu)象）作為抗原底物，創(chuàng)建一種高效、易操作的AQP4-IgG檢測新技術(shù)--IDoT法；之后，邱偉/孫曉渤團(tuán)隊和付瑩團(tuán)隊，聯(lián)合韓國Kim團(tuán)隊自主設(shè)計，并開展為期3年（2020年5月-2023年2月）的前瞻性、病例-對照、國際多中心交叉驗證研究。

圖3：國際首創(chuàng)IDoT法檢測AQP4-IgG示意圖。IDoT法創(chuàng)新性地解決了幾項關(guān)鍵技術(shù)瓶頸：（1）通過溫和手段獲得過表達(dá)的AQP4細(xì)胞膜片段，保留完整空間構(gòu)象的OAP結(jié)構(gòu)，以保持其抗原性；（2）獲得高濃度對照細(xì)胞（不表達(dá)AQP4的239T細(xì)胞）；（3）通過膜碎片預(yù)處理，清除血清中非特異性蛋白，顯著降低背景色。

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該研究在中國（廣東、福建）和韓國共檢測836例患者的血清樣本。結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)CBA法對比（活細(xì)胞CBA法或者固定CBA法等），IDoT法的抗體檢測性能與CBA相當(dāng)，診斷性研究結(jié)果Kappa系數(shù)為98.0%（400例患者）；436例驗證者，包括275例其他疾病隊列（風(fēng)濕免疫疾病等）、57例NMOSD前瞻性隨訪隊列、31例國內(nèi)交叉驗證隊列、73例韓國神經(jīng)免疫疾病隊列交叉驗證（NMOSD、MOGAD等），整體驗證隊列結(jié)果中，僅2例與CBA檢測不一致。因此，IDoT總體敏感性為99.4% （95%CI: 97.8% - 99.9%）， 特異性為99.2%（95%CI: 98.0% - 99.8%）。

圖4：前瞻性、病例-對照、國際多中心交叉驗證研究流程圖

圖5：韓國隊列交叉驗證研究流程圖和結(jié)果

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該研究證明，IDoT法與目前金標(biāo)準(zhǔn)CBA法具有相同檢測效能。但I(xiàn)DoT法高效、易操作，可實現(xiàn)在普通實驗室、一般技術(shù)人員、廣泛人群中進(jìn)行AQP4-IgG抗體檢測，在快速篩查中具有更廣泛的應(yīng)用前景，可實現(xiàn)NMOSD患者早診斷早治療，同時為資源較少和經(jīng)驗不足的基層醫(yī)院以及其他經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國家提供一種可選擇方法，最終實現(xiàn)提高AQP4-IgG抗體檢測率。

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圖6：傳統(tǒng)CBA法需要特殊設(shè)備等，難以廣泛開展；IDoT法有望在普通實驗室，由一般的技術(shù)人員經(jīng)培訓(xùn)后掌握使用，未來可能在社區(qū)人群疾病篩查，甚至患者自行檢測中應(yīng)用。

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該研究成果是我國的自主研發(fā)成果，有效解決國內(nèi)神經(jīng)免疫抗體檢測的“卡脖子”問題，也填補(bǔ)了國際上快速檢測AQP4-IgG抗體領(lǐng)域的空白，對于推動全球NMOSD的早期精確診斷具有重要意義。同時，我國對該成果自主知識產(chǎn)權(quán)的擁有，未來將大大降低NMOSD診斷成本，促進(jìn)患者群體早診斷早干預(yù)，減輕家庭與國家的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。JMMA Neurology在全球享有很高的聲譽和影響力，研究論文得到了JMMA Neurology雜志多個審稿人的高度評價，認(rèn)為 “這項非常詳實的研究將引起神經(jīng)科醫(yī)生的極大興趣，克服在不同醫(yī)療條件下NMOSD抗體檢測的障礙” “該研究發(fā)現(xiàn)將對NMOSD抗體檢測領(lǐng)域產(chǎn)生重大影響” “該研究是神經(jīng)免疫抗體檢測技術(shù)的重大進(jìn)步”。

圖7：克服疫情影響，研究人員與國際神經(jīng)免疫專家（澳大利亞西澳大學(xué)Allan Kermode、美國梅奧診所Sean Pittock、日本九州大學(xué)Noriko Isobe）反復(fù)開展線上討論。